جداسای جدایه های بومی باکتری (bacillus thuringinsis) و شناسایی فنوتیپی و ژنوتیپی آنها در استان آذربایجان غربی

باکتری bacillus thuringiensis (b.t) به عنوان یک میکروارگانیسم و حشره کش بیولوژیک موفق در بین سایر عوامل مطرح می باشد. این باکتری گرم مثبت و اسپوردار بوده و به واسطه ی تولید کریستال پروتئین قابلیت حشره کشی بر روی تعداد زیادی از راسته های حشرات را دارا می باشد. دامنه تاثیر این باکتری به نوع کریستال پروتئین آن بستگی دارد. استرین های مختلف این باکتری، کریستال پروتئین های مختلف دارند. باکتری b.t را از محیط های زیستی نظیر خاک، لاشه ی حشرات، بقایای گیاهی، آب های جاری و گرد و خاک انبارهای مواد غذایی می توان استخراج و خواص فنوتیپی و ژنوتیپی آنرا مورد بررسی و مطالعه قرار داد. در تحقیق حاضر 744 نمونه ی مختلف از 11 مکان مختلف استان آذربایجان غربی که تاکنون هیچ گونه اقدام باکتری پاشی در آن صورت نگرفته بود جمع آوری و مورد ارزیابی قرار گرفت. برای استخراج جدایه های باکتری b.t از روش انتخابی استات سدیم در چهار غلظت (2/0، 25/0، 3/0 و 35/0 مولار با 8/6=ph) استفاده گردید.شناسایی اولیه باکتری براساس وجود کریستال پروتئین و شکل کریستال با استفاده از رنگ آمیزی کوماسی بلو صورت گرفت و بر روی جدایه های حاوی کریستال پروتئین آزمایشات بیوشیمیایی شامل آزمون لسیتیتاز، اسکولین، ساکارز و سالیسین انجام شد. سپس برای تشخیص پائوتیپ جدایه های استخراجی آزمایشات زیست سنجی بر روی آفات شامل پروانه ی سفیده ی کلم (pieris brassicael.) و شب پره ی هندی (plodia interpunctella h.) از راسته بالپولکداران، پشته ی گونه culex pipiens l. از راسته دوبالان و شپشه آرد (tribolium confusum h.) از سخت بالپوشان مورد استفاده قرار گرفت. همچنین برای تشخیص و آشکارسازی ژن های سنتزکننده کریستال پروتئین (cry) در جدایه ها از روش مولکولی با استفاده از تکنیک pcr و آغازگرهای اختصاصی cry1، cry2 و ‍cry9 به عنوان ژن های تولیدکننده ی توکسین موثر بر روی راسته ی بالپولکداران، cry3 و ‍cry7 موثر بر روی راسته ی سخت بالپوشان و cry4 و ‍cry11 موثر بر روی دوبالان استفاده گردید. از 744 نمونه مختلف 301 کلنی بدست آمده که با تجزیه آنها 48 جدایه استخراج گردید. شاخص کل باکتری bacillus thuringiensis (b.t) در این تحقیق 064/0 معادل 4/6 درصد محاسبه گردید. که بالاترین شاخص مربوط به شهرستان خوی (0/147) و پایین ترین آن از ارومیه (041/0) بدست آمد. از چهار غلظت استات سدیم (2/0، 25/0، 3/0 و 35/0 مولار) به ترتیب 13 جدایه (08/27 درصد)، 26 جدایه (16/54 درصد)، 6 جدایه (5/12 درصد) و 3 جدایه (51/6 درصد) استخراج گردید که بیشترین استخراج مربوط به غلظت 25/0 مولار با 26 جدایه (16/54 درصد) بود. بیشترین استخراج جدایه ها از منبع خاک با 66 درصد حاصل شد و در بررسی های شکل شناختی، کریستال پروتئین به شکل هرمی با 19 جدایه (58/39 درصد) بیشترین فرم را به خود اختصاص داد براساس آزمایشهای بیوشیمیایی بیشترین تیپ بیوشیمیایی مربوط به زیرگونه b.t.subsp.kurstaki با واکنش es+sa+le+su- با 12 جدایه (25 درصد) و تیپ های دیگر شامل israelensis b.t.subsp با واکنش es+sa+le+su- و b.t.subsp.galleriae با واکنش es+sa+le+su- هر کدام با 7 جدایه (58/14 درصد) در درجه بعدی قرار گرفتند.در زیست سنجی جدایه ها بر روی آفات شامل پروانه ی سفیده ی بزرگ کلم، شب پره ی هندی، پشه ی کولکس و دو مرحله ی لاروی و حشره کامل شپشه آرد بعد از 48 ساعت تلفات 75 الی 100 درصد بترتیب در پروانه ی سفیده ی کلم و شب پره ی هندی توسط 3 جدایه (25/6 درصد) و 6 جدایه (5/12 درصد) مشاهده گردید، اما در این محدوده (75 الی 100) در روی پشه ی کولکس و لارو حشره کامل شپشه آرد تلفاتی مشاهده نگردید و همچنین بعد از 72 ساعت بر روی سفیده ی کلم، شب پره ی هندی و پشه ی کولکس تلفات 75 الی 100 درصد به ترتیب در 17 جدایه (4/35 درصد)، 17 جدایه (4/35 درصد)، 4 جدایه (8 درصد) و در روی لارو و حشره کامل شپشه آرد تلفاتی در این محدوده مشاهده نگردید. در بخش مولکولی و تشخیص ژن های cry نتایج نشان داد که در 48 جدایه ژن های cry1، cry2، cry3، cry4، ‍cry7، cry9 و ‍cry11 به صورت انفرادی به ترتیب در 47 جدایه (9/97 درصد)، 38 جدایه (79 درصد)، 24 جدایه (50 درصد)، 22 جدایه (8/45 درصد)، 2 جدایه (1/4 درصد)، 6 جدایه (5/12 درصد) و 9 جدایه (75/18 درصد) و به فرم ترکیبی شامل ژن های مولد توکسین در بالپولکداران شامل cry2+cry1، cry1+cry9، ‍cry2+cry9 و ‍cry1+cry2+cry9 به ترتیب در 37 جدایه (08/77 درصد)، 6 جدایه (5/12 درصد)، 4 جدایه (33/8 درصد) و در گروه دوبالان cry3+cry7 در 9 جدایه (75/18 درصد) و در گروه سخت بالپوشان cry4+cry11 در هیچ جدایه ای مشاهده نشد. بیشترین و کمترین ژن تشخیص داده شده در 48 جدایه بترتیب مربوط به cry1 و ‍cry7 با 47 جدایه (9/97 درصد) و 2 جدایه (1/4 درصد) و در فرم ترکیبی نیز cry1+cry2 و cry3+cry7 به ترتیب با 37 جدایه (08/77 درصد) و بدون جدایه مشاهده گردید.